附子生物碱分布规律研究
孙凯李佳张永清
山东中医药大学药学院．山东省高校中药资源学重点实验室
目的：探讨附子中生物碱的分布规律，为确定合理的加工炮制方法、有效控制附子饮片质量提供参考。
方法：将附子横向与纵向分割为不同部分，分别HPLC法测定乌头碱、新乌头碱和次乌头碱等成分含量。
结果：
结论：附子中乌头碱、新鸟头碱和次乌头碱的分布具有一定的规律性，掌握此规律性，可为附子的加工炮制与质量控制提供参考。
附子为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDe—bx．的子根的加工品，始载于《神农本草经》。味辛、甘，大热，有毒；归心、肾、脾经；具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛等功效；用于亡阳虚脱，肢冷脉微，心阳不足，胸痹心痛，虚寒吐泻，脘腹冷痛，肾阳虚衰，阳痿宫冷，阴寒水肿，阳虚外感，寒湿痹痛等症。现代研究发现，附子含有多糖、脂类、醇胺、生物碱等成分，具有强心、抗炎、镇静、降糖等活性，并能兴奋垂体一肾上腺皮质系统uJ，用于治疗心力衰竭、胸痹等疾病[2-3]。在生物碱类成分中以双萜类生物碱最为重要，如乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等，它们既是活性成分又是毒性成分H』，为保证附子饮片质量需要将其含量控制在一定范围内。产地加工与炮制是影响附子中生物碱含量的重要环节，从而对其饮片质量有着非常重要的影响l5
。附子传统加工工艺加工的商品附子多达11个规格，除《中国药典》品种黑顺片、白附片、淡附片、炮附片以外，还有熟附片、挂片、黄附片、刨附片等[6
。其中有的去皮，有的不去皮。不同加工炮制品中，生物碱类成分含量具有明显差异。探讨附子中生物碱类成分的组织分布状况，对于确定适宜的加工炮制方法、有效控制附子饮片质量具有重要意义。
1．1仪器FW-高速万能粉碎机(北京永光明医疗仪器厂)；电热恒温水浴锅(北京医疗设备厂)；C—Z型干燥箱(上海市实验仪器厂)；四元泵，在线脱气机，手动进样器，AgihentChemStation色谱工作站，TC—C18柱(／an，4．6lnlnxmnl)，紫外吸收检测器；微孔滤膜；FA4型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；AGB5型电子天平(美国MEITLERTOLEDO公司)；电热恒温水浴锅(北京科伟永鑫仪器厂)；KQ一E医用超声波清洗器(昆山市超声波仪器
有限公司)。
1．2试剂娃哈哈纯净水；甲醇(一级色谱纯，天津四友精细化学品有限公司)、乙腈(一级色谱纯，TediaCompany，INC．0TediaWay，Fairfield，OHUSA)；标准品：乌头碱(．27．2)、新乌头碱(—64—9)、次乌头碱(—87-4)均为上海源叶生物科技有限公司生产，纯度I98％。其余试剂，均为国产、分析纯。
1．3药材上海康桥中药饮片有限公司提供，年7月采集自四川省江油市，经山东中医药大学周风琴教授鉴定，确认为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliDebx．的子根，鲜品。取子根适量，用刀片从外向内依次将表皮与皮层、韧皮部、木质部、髓等组织分开，分别编号为H1、H2、H3、H4；从顶端到底端平均分成9部分，分别编号为z1、Z2、z3、Z4、z5、z6、z7、z8、z9。将分离后的各个部分，晒干，以粉碎机粉碎，过60目筛，置干燥器中备用。
2实验方法
2．1供试品溶液制备取干燥粉碎后的药粉约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10％氨水3mL，精密加入异丙醇一乙酸乙酯(1：1)的混合溶液50mL，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用异丙醇．乙酸乙酯(1：1)混合溶液补足减失重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇一三氯甲烷(1：1)的混合溶液3mL溶解，滤过，滤液转移至10mL容量瓶中，定容并摇匀，过0．45tan滤膜，作为供试品溶液备用。
2．2色谱条件色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱C18(oDS，mln×4．60nlm，5胛)；检测波长：nm；流速：1．0mL／min；进样量：20止。流动相梯度洗脱条件，
2．3方法学考察2．3．1标准曲线与线性关系精密称取乌头碱、新乌头碱和次乌头碱标准品各10IIlg，置10mL容量瓶中，加O．05％盐酸一甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液A、B、C，浓度为1．0mg／mL，分别稀释配成0．8mg／mL、0．6mg／mL、0．4mg／mL、0．2mg／mL的溶液，作为对照品线性溶液，精密吸取对照品溶液各20止，按“2．2”项色谱条件进行测定，以峰面积与浓度进行回归，得到乌头碱、新乌头碱、次乌头碱在0．1—1．0mg／mL浓度范围内的标准曲线方程，线性关系良好，相关系数均在0．以上，
2．3。2精密度试验精密吸取S6溶液各20牡，按“2．2”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，RSD=1．92％(n=6)，表明仪器精密度良好。
2．3．3重复性试验按“2．1”项下操作，制备6份S6供试品溶液，按“2．2”项下色谱条件各进样20皿，测定峰面积，RSD=2．74％(n=6)，表明重复性良好。
2．3．4稳定性试验精密吸取S6溶液各20肚，分别于0，2，4，6，8，12h各进样1次，测定峰面积，RSD=1．33％(n=6)，表明样品溶液在12h内稳定性良
好。
2．3．5加样回收试验精密称取已知含量的s6号样品6份，各0．5g，分别精密加入乌头碱、新乌头碱和次乌头碱对照品适量，按“2．1”项下制备样品溶液，
按“2．2”项下色谱条件测定峰面积。分别进样3次，根据公式(C—A)／B×％计算，结果平均加样回收率为94．53％，RSD=1．84％，表明具有较好回收率。
2．4样品含量测定取各样品溶液，按“2．2”项下色谱条件测定，记录新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的峰面积，根据各生物碱标准曲线计算其含量。每样品重复3次。
3结果与分析
3．1生物碱在附子中的横向分布
将附子由外向内大体将表皮与皮层、韧皮部、木质部及髓部分开，经测定，其乌头碱、新乌头碱和次乌头碱含量如表3所示。
表3结果显示，新乌头碱、乌头碱与次乌头碱在附子各组织中的分布状况是不一样的，新乌头碱、次乌头碱及总生物碱均以韧皮部含量最高、表皮与皮层含量最低，而乌头碱却以髓部含量最高、韧皮部含量最低。
3．2生物碱在附子中纵向分布
用刀片将附子从顶端至底端分割为9个部分，分别测定其生物碱含量，结果如表4所示。
表4结果显示，附子从顶端至底端新乌头碱、乌头碱含量最高的部位分别为第2节段、第9节段，次乌头碱、总生物碱含量最高的部位为第1节段，新乌头碱含量最低的部位为第5节段，乌头碱、次乌头碱及总生物碱含量最低的部位均为第4节段。各种生物碱含量变化的大体趋势均表现为先降低后升高再降低。
4小结
生物碱属于植物次生代谢物质，其合成与积累与植物体内的生理生化代谢活动密切相关。一般来讲，代谢越旺盛的部位，次生代谢物质合成与积累的越多，含量越高。本实验结果显示，次乌头碱、新乌头碱、乌头碱及总生物碱在附子中的分布具有一定的规律性。在横向上，以韧皮部含量最高，表皮与皮层含量最低；在纵向上，上端含量最高，往下不断降低，然后又有升高和降低，直径最大部位的生物碱含量较低。
附子生物碱分布的规律性，决定于根部生理生化代谢活动。韧皮部具有输导有机物质的作用，其代谢活动强烈，所以其中的生物碱含量较高。表皮、皮层、木质部、髓部死亡细胞较多或发挥贮藏功能，代谢强度相对较低，所以其生物碱含量较低。根部上端是母根相连处，各种维管束比较集中，代谢活动强，生物碱含量高。在中部直径较大的部位，贮藏组织发达，其皮层与髓部所占比例相对较大，所以生物碱含量偏低。根部下端贮藏组织减少，微管组织相对发达，所以其含量又有升高。根部末端表皮与皮层所占比例增大，使得生物碱含量再次降低。
掌握附子生物碱分布规律，可为选择加工炮制方法、控制饮片质量提供参考，如去除子根顶端和低端、去皮时深达木质部等均可以有效降低生物碱含量。
参考文献：
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