森林种植园覆盖了全球约7%的森林，其中四分之一是由非本地物种和种间杂种组成，这些种植方式导致了对本地生态系统的侵蚀或基因混入。桉树作为世界上种植最广泛的林木类群之一，若消除外来或基因工程桉树的有性繁殖可以大大降低传播和入侵的可能性，同时能保留改良基因型固有的理想营养生长和适应性特征。此外，LEAFY（LFY）基因具有其高度的保守和两性功能，是对外来物种一个很好的性遏制目标。为了减少通过花粉和种子的基因交流，该研究利用CRISPRCas9技术来研究LFY的桉树直系同源基因ELFY的生物学功能，发现CRISPR突变后产生了不确定花序的表型，但不影响正常的幼体发育。近日，国际著名杂志PlantBiotechnologyJournal在线发表了美国俄勒冈州立大学森林生态系统与社会系StevenH.Strauss团队题为“Geneticcontainmentinvegetativelypropagatedforesttrees:CRISPRdisruptionofLEAFYfunctioninEucalyptusgivessterileindeterminateinflorescencesandnormaljuveniledevelopment”的研究论文。根据ELFY与桉树开花的关系，确定ELFY是否是有效的遏制目标。在这项研究中，首先，作者重新转化了三种CRISPRCas9构建体，以诱导ELFY中的功能缺失突变。在获得的转系基因株系中实现了很高的双等位基因敲除，接近转基因插入事件的％。接下来，作者为检测突变是是否稳定存在，对10个ELFY敲除转基因事件的ELFY等位基因进行了重测序，以测试发育早期发现的突变是否因Cas9的过度表达而发生了变化。结果显示，在靶标位点外没有观察到DNA序列的变化，这为突变和表型效应稳定性提供了证据。接下来，作者在CRISPR突变的野生型背景下进行了第二次温室研究，以确定ELFY突变是否会影响幼年营养性状或生长发育。结果显示，在所有移码和突变去除了保守氨基酸的转基因事件中，都产生了不育的、不确定的花状器官，或者没有花的表型，但ELFY的突变对幼苗营养生长速率或叶片形态与转基因对照没有统计学上显著或大的差异，表明，这些突变体在其他方面显然是正常的。最后，为了了解基因表达是否有助于解释突变体生殖器官中的修饰，作者对6个ELFY突变株系和3个对照株系，分析了包括ELFY在内的12个开花基因的基因表达差异。结果显示，当ELFY突变后，在花卉发育途径中上游或靠近ELFY的基因过表达，而ELFY下游的基因在花器官表达下调（图1）。作者得出结论，ELFY功能的破坏是一种有效的性遏制性工具，且不会对苗期的植物生长或叶片形态造成统计学上的显著或大的不利影响。

图1

综上所述，CRISPRCas9提供了一种消除ELFY功能的有效方法，从而提供了一种防止雄性和雌性有性生殖的方法，而不会对植物产生不利影响。在田间树木的长寿命期内，预计它也更稳定，特别是与以前的不育诱导方法相比，其效力可能随环境和发育扰动而变化。然而，鉴于森林树木在野外条件下复杂的生理和成熟过程，这一结论必然是试验性的。如果在自然开花的情况下，仍然保持不育性，则有助于加快获得监管部门的批准，更好地接受外来品种或基因工程品种，从而加快转基因和基因编辑树木所提供的改良性状的应用。

原文链接：