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引用本文：

谯英固，周明，胡英还，王呈谕，刘晓璇，沈亮亮，孙震晓.何首乌与制何首乌对人尿源性干细胞的作用差异及机制研究[J].中国药物警戒.,18(3):-.

何首乌与制何首乌对人尿源性干细胞的作用差异及机制研究

StudyontheDifferentialEffectsandMechanismofPolygoniMultifloriRadixandPolygoniMultifloriRadixPraeparataonHumanUrine-derivedStemCells

——何首乌肝毒性研究专栏

正文

何首乌为蓼科植物何首乌（polygonummultifl-orumThunb.)的干燥块根，为临床常用中药。年版《中国药典》收载了何首乌及其炮制加工品制何首乌，二者功能主治有所不同：何首乌味苦、甘、涩，微温，归肝、心、肾经，能解毒，消痈，截疟，润肠通便，而制何首乌能补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨，化浊降脂。

人尿源性干细胞（humanurine-derivedstemcells,hUSCs）是从尿液中分离培养的具有良好增殖活性和多向分化能力的细胞亚群，具有间充质干细胞（marrowmesenchymalstemcells,MSCs）样生物学特性。与胚胎干细胞和其他MSCs相比，hUSCs没有伦理学争议，且提取方法简单、安全、无创、低成本，在药物活性及毒性替代筛选方面有一定潜力。本文利用hUSCs研究何首乌与制何首乌对细胞的影响，在细胞水平初步探究其生熟异治的物质基础及分子机制。

何首乌水提物（PMR）与制何首乌水提物（PMRP）均含有分别以二苯乙烯苷（2,3,5,4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside,TSG）和大黄素（emodin,EM）为主要代表成分的二苯乙烯苷类和游离蒽醌类化合物。在炮制过程中，游离型蒽醌含量比例逐渐升高，而二苯乙烯苷、结合型蒽醌含量均有所下降。本研究首先利用高效液相色谱（HPLC）测定PMR及PMRP中TSG和EM含量，在考察PMR及PMRP对hUSCs作用的基础上，单独及按比例联合TSG和EM作用hUSCs，研究2种主要成分比例对hUSCs活力的影响，及其对hUSCs周期和凋亡及相关蛋白表达的影响，探讨其作用差异的分子细胞生物学机制。

1实验材料

1.1药材

何首乌（产地：贵州；批号：）、制何首乌（产地：贵州；批号：）饮片购自贵州同源中药发展有限公司，经北京中医药大学刘春生教授鉴定，均为正品。

1.2药品与试剂

标准品：TSG（）、EM（）（维科奇生物科技有限公司）；MTT、牛血清白蛋白（拜尔迪生物技术有限公司）；AnnexinⅤ/PI双染细胞凋亡试剂盒（BD公司）；BCA蛋白定量试剂盒（Ther-moFisherScientific）；硝酸纤维素膜（NC膜）（Pall公司）；Rb抗体小盒、CDK2抗体（CellSignalingTechn-ology）；CDK1抗体、p21抗体（ProteintechGroup）；β-actin抗体（全式金生物技术有限公司）。

1.3细胞及培养基

按文献方法收集健康志愿者新鲜尿液样本，洗涤、离心，沉淀用hUSCs培养基重悬后接种于24孔板，记为P0代，常规培养、传代，本研究使用P2~P5代hUSCs进行研究。本研究经北京中医药大学伦理审查委员会批准，志愿者均签署知情同意书。

2实验方法

2.1PMR和PMRP的制备

按文献方法，分别称量.08g何首乌饮片和.12g制何首乌饮片加入圆底烧瓶中，加10倍体积蒸馏水煎煮2h，过滤。再加8倍体积蒸馏水煎煮1.5h，过滤，合并2次滤液置于旋转蒸发仪中浓缩后冷冻干燥至恒重，密封避光保存。

2.2TSG及EM含量测定

2.2.1供试品及标准品溶液制备?分别称取PMR及PMRP粉末16mg，加甲醇2mL后称重，超声溶解40min后，用甲醇补重至原始重量，0.22μm滤膜过滤，备用。分别精密称取TSG及EM标准品4.05、2.02mg，加甲醇溶解定容至5mL，即得浓度为及μg/mL的TSG及EM储备液。

2.2.2HPLC条件?色谱柱：CAPCELLAK-C18（×4.6mm，5μm）；流动相：A-甲醇，B-0.1%磷酸水溶液；检测器：UV检测器；检测波长：nm；流速:1mL/min；进样体积：10μL；柱温：室温。梯度洗脱：0min，30%A，70%B；18min，48%A，52%B；20min，70%A，30%B；30min，75%A，25%B；35min，90%A，10%B；42min，%A；44min，%A[14]。

2.2.3方法学考察?线性关系：精密吸取TSG储备液92、、、、μL于2mL容量瓶中，加甲醇定容，0.22μm滤膜过滤；精密吸取EM储备液37、74、、、μL于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，0.22μm滤膜过滤，进样。精密度：精密吸取供试品溶液，连续进样6次测定峰面积，计算TSG及EM的RSD值。稳定性：精密吸取供试品溶液，分别在第0、2、4、8、12、24h进行检测，计算TSG及EM的RSD值。重复性：取同一批水提物粉末6份，按照供试品溶液制备并进行测定，计算TSG及EM的RSD值。回收率考察：精密称取6份水提物（约0.1g），分别加各标准品溶液适量，按照供试品溶液制备并进行测定，计算TSG及EM的平均回收率及RSD值。

2.3MTT法检测细胞活力

单细胞hUSCs悬液，以细胞/孔接种细胞于96孔培养板中，24h后换含不同浓度药物的培养基（表1），以不含药物的空白培养基培养hUSCs作对照，分别培养1、3、5d后，酶标仪检测吸光度值。细胞活力（%）=（药物组平均吸光度值/对照组平均吸光度值）×%。

2.4流式细胞术检测细胞周期

单细胞hUSCs悬液以细胞/孔接种于6孔板，24h后换含不同浓度药物的培养基，每组平行3孔，常规培养5d。收集各组全部细胞（贴壁细胞使用0.25%无EDTA胰酶消化），预冷PBS洗涤，预冷70%乙醇-20℃固定过夜。PBS洗涤，加入终浓度μg/mLRNA酶，37℃水浴30min，加入终浓度μg/mLPI染液，4℃避光染色40min，流式细胞仪检测细胞周期分布情况,ModFitLT5.0软件分析细胞周期。

2.5AnnexinⅤ/PI双染结合流式细胞术法测定细胞凋亡

如2.4收集全细胞至离心管，按试剂盒说明PBS洗涤细胞2次，加μL缓冲液重悬，加5μLAnnexinⅤ-FITC和5μLPI混匀，避光孵育5~15min，流式细胞仪检测荧光强度。

2.6Westernblot

单细胞hUSCs悬液以细胞/孔接种于6孔板，24h后换含不同浓度药物的培养基，每组平行3孔，常规培养5d。常规收集细胞、裂解液裂解，按BCA蛋白定量试剂盒说明测定蛋白浓度，聚丙烯凝胶电泳后目的蛋白电转移至NC膜，脱脂牛奶封闭2h，孵育一抗4℃过夜，TBST洗3次，每次5min，二抗孵育1h，TBST洗3次，每次5min，用ECL发光液显色，于全自动化学发光成像仪下拍照。

2.7数据处理及统计学分析

实验数据采用SPSS19.0统计软件进行分析，所有测定数值以x±s表示，采用单因素方差分析（ANOVA）及SNK-q检验进行组间比较，采用双因素方差分析进行交互作用分析。

3实验结果

3.1PMR与PMRP制备及TSG和EM含量测定

根据HPLC色谱图，PMR中为EM及TSG的含量分别为0.53及77.68mg/g；PMRP中为EM及TSG的含量分别为0.36及29.37mg/g（图1，表2）。

3.2PMR及PMRP对hUSCs的作用差异

与对照组相比，PMR在0.05mg/mL和0.1mg/mL对细胞活力无抑制作用，且在第5d时具有微弱的促进作用。在第3d及第5d，0.5和1mg/mL对细胞活力具有显著抑制作用；PMRP在作用第5天4个浓度均对细胞活力有一定程度的促进作用（图2）。

3.3PMR及PMRP对hUSCs的作用差异机制

3.3.1TSG和EM单用及联用对hUSCs活力的影响根据PMR及PMRP中TSG和EM含量百分比，研究TSG和EM单用，及按照PMR和PMRP中两成分比例联用对hUSCs细胞活力的影响（表1)。

TSG、EM单独作用于hUSCs，第1、3、5d的细胞存活率结果如图3所示。TSG作用第5天，仅在40、80μmol/L对hUSCs活力有促进作用，在、μmol/L显著抑制；EM作用第5d时促进细胞活力，其中1、2、4μmol/L在第3d时也具有促进作用。

联合作用于hUSCs，1∶低浓度组对细胞活力均无明显作用，“EM4μmol/L+TSGμmol/L”在第3、5d时均明显抑制细胞活力，“EM2μmol/L

+TSGμmol/L”组在第5d时也具有显著抑制作用；当按1∶80给药时，“EM0.5μmol/L+TSG40μmol/L”组和“EM1μmol/L+TSG80μmol/L”组在第5d促进细胞活力，仅“EM4μmol/L+TSGμmol/L”组在第5d时一定程度抑制细胞活力，其余组无明显影响（图4）。因此，当EM浓度相同时，1∶对hUSCs细胞毒作用明显，而1∶80在较低浓度促进细胞活力，与PMR及PMRP对hUSCs的作用一致。

将第5d各组细胞OD值进一步对比（图5），1∶80或1∶联用组OD值均较EM单用组有所降低，且1∶组抑制作用更强；2种比例给药后A值大多低于TSG单独给药，且较高浓度更加明显，在“EM4μmol/L+TSGμmol/L”和“EM4μmol/L+TSGμmol/L”组中具有显著性差异。结果表明，EM与TSG联合给药对hUSCs细胞活力的影响具有交互作用。

3.3.2PMR及PMRP以及EM和TSG按比例联用对hUSCs细胞周期的影响?基于MTT实验，选择MR（0.5mg/mL）、PMRP（0.5mg/mL）、1∶联用组“EM2μmol/L+TSGμmol/L”及1∶80联用组“EM2μmol/L+TSGμmol/L”，研究其对hUSCs细胞周期的影响。与对照组相比，PMR组和1∶组hUSCs细胞周期显著改变（表3）。

3.3.3PMR及PMRP以及EM和TSG按比例联用对hUSCs细胞凋亡的影响?对hUSCs细胞凋亡的浓度设置同周期实验，PMR诱导hUSCs总凋亡率（3.42±0.28）%，PMRP组（0.35±0.05）%；1∶组（4.66±0.96）%，1∶80组（0.45±0.12）%。与对照组总凋亡率（1.6±0.07）%相比，PMR组和1∶组细胞凋亡率较PMRP组和1∶80组高（表4）。

3.3.4PMR、PMRP对hUSCs细胞周期相关蛋白表达的影响?基于细胞周期和凋亡实验结果，推测PMR及EM与TSG按1∶联用所致细胞毒性主要由细胞周期阻滞引起，进一步选择PMR（0.5mg/mL）及PMRP（0.5mg/mL）检测细胞周期蛋白表达（图6）。

相比对照组，PMR组促周期运转的磷酸化Rb（pRbS、pRbS/）、CDK2、CDK1表达均下调，周期阻滞蛋白p21水平上升，PMRP组磷酸化Rb（pRbS、pRbS/）、CDK2、CDK1水平升高，表明对G1/S期转换有促进作用，结果与PMR及PMRP对细胞周期的作用一致。

4讨论

本文选择hUSCs研究PMR与PMRP对成体干细胞的作用差异。PMR在0.5、1.0mg/mL时对hUSCs有明显毒性，而PMRP一定程度上促进细胞活力。TSG及EM均为药典中何首乌质控成分，何首乌在炮制过程中TSG/EM的比例降低，提示2种水提物的作用差异可能与EM与TSG的含量变化导致的比例改变有关。通过研究PMR和PMRP，TSG和EM单用及联用对hUSCs的影响发现，PMR及EM与TSG对应比例1∶联用时细胞毒作用更强，细胞凋亡率较PMRP组和1∶80联用组高，且对细胞周期阻滞的影响更为明显。

当细胞处于G0/G1期时非磷酸化Rb维持较高水平，Rb磷酸化可推动G1/S期转换，从而促进细胞周期进程。CDKs为丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）激酶系统，各种CDKs沿细胞周期时相交替活化、磷酸化相应底物，使细胞周期事件有条不紊进行。p21为一种CDKs抑制剂，其表达水平增加会阻滞细胞周期运转。本研究表明，PMR组p21水平上升，CDK2、CDK1表达下调，降低了Rb磷酸化水平，从而抑制了细胞周期转换和分裂增殖，而PMRP组CDK2和磷酸化Rb水平均升高，表明促进了G1/S期转换和细胞增殖。

制何首乌在中医临床常用以滋补肝肾，但近年来有关何首乌、制何首乌及其制剂的临床肝毒性报道引起广泛